题 课题 3 酵母细胞的固定化 课题背景 如今，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域。在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本：反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
于是，有人设想，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。高果糖浆的生产就是固定化酶技术成功地应用于工业生产的实例。
酶是由细胞合成的，于是，又有人设想，能否将合成酶的细胞直接固定？自 20 世纪 70 年代，在固定化酶技术的基础上，又发展出了细胞固定化技术。与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。
（一）固定化酶的应用实例 我们以高果糖浆的生产为例来了解固定化酶技术在生产实践中的应用。高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的稳定性好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。
使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内（图4-5），柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。目前，用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆的规模已经超过了每年 1000 万吨。
高果糖浆是指果糖含量为 42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人类的健康更有益。
（二）固定化细胞技术 固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法（图 4-6）。一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积大，而酶分子很小；体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶容易从包埋材料中漏出。
从操作角度来考虑，你认为哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？ 本课题使用包埋法来固定细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞（图 4-7）。
实验操作 （一）制备固定化酵母细胞 1 ．酵母细胞的活化 称取 1g 干酵母（图 4-8），放入 50mL 的小烧杯中，加入蒸馏水 10mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置 1h 左右，使其活化（图 4-9）。
在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。
2 ．配制物质的量浓度为 0.05mol/L 的 的 CaCl 2 溶液 称取无水 CaCl 2 0.83g，放入 200mL的烧杯中，加入 150mL 蒸馏水，使其充分溶解，待用。
3. 配制海藻酸钠溶液 称取 0.7g 海藻酸钠，放人 50mL 小烧杯中，加人 10mL 水，用酒精灯加热，边加热边搅拌（图 4-10），将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至 10mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。
4. 海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀（图4-11），再转移至注射器中。
5. 固定化酵母细胞 以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl 2 溶液中，观察液滴在 CaCl 2 溶液中形成凝胶珠的情形（图 4-12）。将这些凝胶珠在 CaCl 2 溶液中浸泡 30min 左右。如果没有注射器，可以在小塑料瓶上安装一个孔径为 2mm的喷嘴来使用。
（ 二 ）
用固定化酵母细胞发酵 1．将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗 2-3 次。
2．将 150mL 质量分数为 14%的葡萄糖溶液转移到 240mL 的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于 25℃下发酵 24h（图 4-13）。
操作提示 海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例如，加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
结果分析与评价 1.观察并描述形成的凝胶珠的颜色和形状。
2.观察利用固定化酵母细胞发酵的葡萄糖溶液，看看是否有气泡产生，闻闻是否有酒味。
课堂延伸 如果希望反复使用固定化酵母细胞，就需要避免其他微生物的污染。在工业生产中，细胞的固定化是在严格无菌的条件下进行的。
结合专题 2 的无菌操作技术，想一想如果要求制作反复使用的固定化酵母细胞，应该在实验过程中注意哪些问题？ 相关链接 结合专题 1 中的课题 1，想一想，是否可以利用固定化细胞发酵制果酒和果醋，使用固定化细胞能否达到连续生产的目的？有兴趣的同学不妨试一试。
练习 1.直接使用酶、使用固定化酶和使用固定化细胞催化反应，各有哪些优点与不足？ 2.你能写一篇短文，描述葡萄糖分子通过固定化酵母细胞转变成酒精的过程吗？ 3.目前，还没有一种固定化技术能普遍适用于所有的酶。在实际应用中，需要根据各种酶的特性，探索最佳的固定化途径。你能解释为什么很难找出一种普遍适用的固定酶的方法吗？
资料 使用须知
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老司机：汉水丑生
2016 年 4 月 27 日