王 婷，秦文韬，吕鹏辉，张震东，王 晔，段留生，李润枝
(农业应用新技术北京市重点实验室，植物生产国家级实验教学示范中心，北京农学院 植物科学技术学院，北京102206)
黄瓜(CucumissativusL.)，又称胡瓜，是葫芦科一年生园艺蔬菜植物，分布于世界各地，也是中国温室及大棚园艺蔬菜的主栽品种之一。随着人们对黄瓜产量和质量的需求逐渐增长，迫切需要能够保持较高种子活力[1]的黄瓜种子。黄瓜种子随着贮藏时间的增加，种子老化劣变的几率和程度也随之上升。
种子活力[2]相比其他指标，更能准确反应黄瓜种子在实际应用中的出苗情况[3]。种子活力大小影响幼苗的生长以及后期的结实率[4]。在加快种子发展速度的同时要控制好种子质量的监测[5]。
黄瓜种子的萌发喜温，但温度过高会导致黄瓜种子内有毒物质积累量增加。黄瓜种子的自然成熟程度达到顶峰，种子活力也会出现不同程度、不可逆的自然衰退，导致种子发芽率下降，抗逆性变差，甚至发芽能力可能完全丧失。黄瓜种子的自然老化过程时间较长，且老化过程中环境影响因素不稳定，试验误差较大，实践价值不高，因此常用人工加速老化法研究种子活力在老化过程中的变化规律[6]。人工加速老化法是通过研究种子构造和生理生化反应的变化得到试验结果[7]，是种子活力的常用检验方法之一。种子在老化过程中会发生种子结构和生理生化特性的改变。
人工加速老化的方法能够较好与自然老化的结果相吻合，目前主要应用在玉米[8]、水稻[9]、小麦[10]等多种粮食作物上，对于黄瓜等经济作物的研究还鲜有报道。就此对30份黄瓜品种进行人工老化试验，为人工加速老化法检验黄瓜种子活力的应用提供理论依据，也为黄瓜耐老化品种的筛选与高活力种子的选育提供参考。
1.1 供试材料
供试材料由天津绿丰种业有限公司提供。人工加速老化条件筛选试验材料为3个黄瓜种批，编号为Lot1、Lot2、Lot3；
人工加速老化发芽试验材料为30个黄瓜品种，其含水量约为8%。
1.2 试验方法
1.2.1 处理时间的筛选 经预试验选择温度为45 ℃、相对湿度为75%是黄瓜种子老化处理的适宜条件。在玻璃干燥器内加入1 L预先配制的NaCl饱和盐溶液，将装有种子的老化盒置于干燥器的隔板上，在玻璃干燥器的磨口边缘均匀涂上凡士林，然后放置于烘箱内，设置温度45 ℃，分别老化2、4、6、8、10、12及14 d，未处理的种子为对照。处理结束后，取出种子样品，薄摊，放在室温下自然风干7 d后进行发芽试验，发芽条件同发芽试验。
1.2.2 标准发芽试验 参照纸上发芽法。从成熟种子中选取饱满、大小均一的种子，在1%次氯酸钠溶液中浸泡消毒30 min，去离子水冲洗2～3次，擦去种子的表面水分，均匀摆放在铺有2层湿润滤纸的发芽盒中(19 cm×13 cm×12 cm)，各设置3个重复，每个重复中放置50粒，置于恒温培养箱中进行25 ℃、24 h全光照培养。种子置床之后每24 h观察1次，以黄瓜种子胚根突破种皮2 mm为发芽标准，记录发芽粒数，并补充适量去离子水以保证滤纸湿润，直至试验结束。
1.3 测定项目
发芽势GE(%)=第2天发芽数/50×100 %；
发芽率GP(%)=7天总发芽数/50×100 %；
发芽指数GI=∑ (Gt/Dt)。
平均发芽时间MGT=∑(Gt·Dt)/∑Gt。式中：Dt为发芽天数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数。
萌发指标的相对值：
相对发芽势RGE=人工加速老化发芽势/对照发芽势×100 %；
相对发芽率RGP=人工加速老化发芽率/对照发芽率×100 %。
相对发芽指数RGI=人工加速老化发芽指数/对照发芽指数；
相对平均发芽时间RMGT(倍)=人工加速老化相对发芽天数/对照种子发芽天数。
1.4 模糊隶属函数法
根据《试验统计分析》进行数据处理和分析。
μ(Xi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)
(1)
μ(Xi)=(Ximax-Xj)/(Ximax-Ximin)
(2)
式中：Xi为各黄瓜品种中相应鉴定指标(i)的相对值，μ(Xi)为各品种鉴定指标Xi的隶属函数值，Ximax，Ximin分别为30个黄瓜品种中各指标相对值(Xi)的最大值和最小值。正相关用公式1，负相关用公式2。
平均隶属函数值：Xi=∑Xij/n
将各隶属函数值进行计算，取平均值，按照均值大小排序，对30个黄瓜品种的抗老化能力进行综合评价；
通过SPSS 23.0对隶属函数值进行聚类分析。
2.1 黄瓜种子人工加速老化时间的确定
由图1可知，随着人工加速老化处理时间的延长， Lot1、Lot2、Lot3黄瓜种子的发芽率均呈现出明显的下降趋势，说明在高温高湿条件下，黄瓜种子的老化劣变程度会随着处理时间加深。当老化时间到第10 天时，与未经过老化处理的种子相比，其发芽率分别由100 %、95 %和82 %下降到80%、70 %和40 %，发芽率的下降幅度在种批之间差异较大。即黄瓜种子在人工加速老化条件为45 ℃、75%RH、10 d时，可以更好体现出黄瓜种子不同品种间的抗老化能力。
图1 老化时间对黄瓜种子发芽率的影响Fig.1 Effect of aging time on germination percentage of cucumber seeds
2.2 老化处理对30份黄瓜品种种子萌发的影响
根据表1可知，30个黄瓜品种(LF 1-30)进行标准发芽试验，发芽率变化范围在92%～100%，平均发芽时间平均在2～3 d，差异幅度较小，无法判断不同品种黄瓜种子间的活力差异。
由表1可以看出，30个不同品种黄瓜种子的萌发明显受到人工加速老化处理的影响，相对发芽率的变化范围在50～105，平均发芽时间相比对照有明显延长，方差分析结果表明经过老化处理后，不同品种的黄瓜种子间活力存在显著差异。因此，通过人工加速老化试验，可以体现出30个不同品种黄瓜种子的耐老化能力及种子活力的差异性。
表1 30个黄瓜品种标准发芽试验萌发指标和人工老化相对萌发指标Tab.1 Germination indicators of 30 cucumber varieties in standard germination test and relative germination indicators of artificial aging
2.3 30个黄瓜品种耐老化能力的综合评价结果
由表2可得，30个品种的黄瓜种子D值的范围为0.114～0.910。其中，相较于其他材料，LF-23的耐老化能力最强，D值为0.910；
LF-15的耐老化能力最弱，D值为0.144。
表2 30个黄瓜品种在人工老化处理下各发芽指标隶属函数值Tab.2 Membership function value of each germination indicator of 30 cucumber varieties under artificial aging treatment
2.4 30个黄瓜品种聚类分析结果
为了明确30个不同品种黄瓜种子耐老化能力的高低，将黄瓜种子按照D值降序排序，采用组间连接的方式、以平方Euclidean度量标准对黄瓜材料数据进行聚类分析。如图2所示，以6为切割点，将30个黄瓜材料划分耐老化品种、中度耐老化品种和老化敏感品种为3类，其中，耐老化品种包括LF-23、LF-30、LF-21、LF-10、LF-3、LF-26、LF-24、LF-22、LF-4、LF-28、LF-29、LF-12、LF-20、LF-27、LF-8、LF-2、LF-5、LF-7，D值在范围在0.608～0.910，共18个材料；
中度耐老化品种包括LF-9、LF-14、LF-16、LF-25，D值在范围在0.468～0.556，共4个材料；
老化敏感品种包括F-19、LF-17、LF-18、LF-1、LF-13、LF-11、LF-6、LF-15，D值在范围在0.114～0.390，共8个材料。
图2 30个黄瓜品种聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 30 cucumber varieties
选用具有明显生长优势和较大生产潜力的高活力种子是作物种子田间育苗成功的关键。因此在生产之前，是否能够准确且迅速地测定种子活力决定了种子在田间种植时的发芽率和种苗健壮程度[11]。种子贮藏过程中，由于种子进行呼吸作用，其内部会积存热量和水分，且会向外界持续散发。若贮藏的种子数量过多，贮藏空间内的通风条件差，就会导致种子散发的热量和水分无法及时排出，进一步加剧种子热量的散发。这样的环境会加速种子老化劣变，对后续的生产造成很大影响。人工加速老化法是测定种子活力的有效方法之一，前人在多种作物中的研究表明，种子经过高温高湿条件下的人工加速老化处理后，其活力显著降低，且随老化时间的增加，种子活力逐渐降低甚至失去发芽能力[12]。郑单958和先玉335在50 ℃、RH 95%的人工加速老化条件下处理8 d后，发芽率下降到0[13]；
甜玉米甜农88和甜农99在41 ℃、相对湿度90%条件下老化处理6 d，发芽率在80%以上[14]；
小麦在高温高湿的条件下处理9 d后也能保持较高的发芽率和根系活力[15]。不同的种子由于其原始含水量、相关作用酶及有关基因组的不同，在不同的环境条件下生长、发育、收获、贮藏，对人工加速老化处理的响应程度也不同[16]。
前人研究表明[17]，种子一般在老化5～7 d后，发芽率等萌发指标明显降低，种子活力降低，在预试验中，筛选黄瓜种子的适宜老化处理条件时发现，随着老化时间的延长，种子活力降低程度逐渐增加，老化处理10 d，能够较好地反映老化处理对黄瓜种子活力的影响，与前人研究结果一致。本试验中，经过人工加速老化试验发现，黄瓜种子的发芽率显著降低，种子活力降低。此试验为人工加速老化法测定种子活力在黄瓜种子生产中的应用提供了理论依据。
模糊隶属函数法反映评价指标，在评价植物抗逆性时广泛使用[18]，并且采用隶属函数法对作物进行评价，优于单一指标评价法，能够全面反映作物的抗逆能力。本试验通过筛选出的人工加速老化条件，对30个黄瓜品种进行种子活力测定，并运用模糊隶属函数法，对30个黄瓜品种进行评价，结果发现LF-23的隶属函数值最大(0.910)，LF-15的隶属函数值最小(0.114)。同时对30个黄瓜品种进行聚类分析，与芦露等[19]用聚类分析法筛选出6个华北型黄瓜强耐冷性品种的方法一致。将供试的黄瓜种子进行聚类分析，根据耐老化程度分为三类，分别为耐老化品种、中度耐老化品种和老化敏感品种。本试验结果可为黄瓜耐老化品种的筛选与高活力种子的培育选择提供理论依据，为利用人工加速老化法检测黄瓜种子活力的条件和适用性提供参考。
通常，种子加工贮藏过程中，由于贮藏时间不同，种子会发生不同程度的老化劣变。引发种子发生老化的原因主要分为两类，外在因素主要包括环境温度、环境湿度、环境中的氧气以及部分微生物，内在因素主要包括种子的内在生理结构、种子的遗传物质、种子内相关酶的种类和含量。当种子的贮藏外界条件一致时，不同种子生理上的差异和相关基因的表达是影响种子的老化程度和造成种子间老化差异的主要原因[20]。目前对于种子老化的机理和如何提高老化种子的种子活力等方面还没有深入研究和讨论，需要通过后续对于生理生化方面的试验或者进行相关基因调控的试验，研究种子老化过程中参与代谢的内部物质、酶的相互转化作用以及基因的调控，从而培育耐老化能力更强的品种，延长种子贮藏年限，最大程度上保证农作物的产量和质量，达到节约种质资源的目的。
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