王 锦 张连全 王文亮 赵正伟 马 青* 温学飞
(1.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川750000；
2.宁夏朔牧盐池滩羊繁育有限公司，吴忠751100；
3.宁夏农林科学院荒漠化治理研究所，银川750000)
滩羊产业是宁夏“六特”产业之一，同时也是农民脱贫致富、乡村振兴的当家畜种。近年来，由于畜牧养殖数量和规模不断的增加，饲草料短缺已经成为制约草畜产业健康发展的瓶颈之一，饲草料供需矛盾也逐年增加。
柠条是锦鸡儿属植物，是一种多年生豆科灌木，主要分布于我国西北荒漠与半荒漠草原上。有研究表明，柠条富含蛋白质和多种动物体必需氨基酸，同时还含有生物碱、黄酮类、香豆素类等功能性物质，具有较高的饲喂价值[1]，也是当地牲畜一种重要的粗饲料来源[2]。然而，柠条枝干含有不容易被消化的纤维素和木质素，而且随着柠条生长年限的延长，其木质素和粗纤维含量也随之增加[3]，同时由于其富含鞣酸和一些挥发性物质，从而造成适口性差，消化率低[4]，很难被牛、羊等动物吸收利用。
微生物发酵有效解决了柠条难以被利用的缺点，成为柠条开发利用的主要途径之一。发酵饲料是以微生物、复合酶为生物饲料发酵剂，将饲料原料转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸。发酵饲料具有提高饲料营养水平、促进动物生长、维持动物肠道菌群平衡、提高动物免疫力等优点[5]。随着近年来盐池滩羊产业的快速发展，微生物发酵饲料的应用范围日益广泛，已然成为众多养殖户的首选饲料之一，应用效果良好。因此，本研究采用乳酸菌+酵母菌+BY-H-Y复合菌剂将配制好的柠条饲料进行发酵，然后按照不同添加比例与未发酵的柠条饲料混合后饲喂滩羊，通过研究柠条发酵饲料对滩羊生长性能和瘤胃微生物多样性的影响，旨在探讨柠条发酵饲料在滩羊饲粮中的适宜添加比例，为柠条发酵饲料在宁夏滩羊中的应用提供数据支持。
1.1 试验饲粮与试验设计
饲粮由精饲料与粗饲料组成，其中柠条(包括发酵与不发酵)作为粗饲料占饲粮的20%，柠条饲料组成见表1。配制好的柠条饲料(全混合日粮)分成2部分，一部分不发酵，一部分添加菌种(乳酸菌+酵母菌+BY-H-Y复合菌剂)经过发酵后成为柠条发酵饲料。按照表2中的饲喂方案，把柠条发酵饲料与柠条饲料按照不同比例混合后进行饲养试验。
表1 柠条饲料组成(干物质基础)
饲养试验于2019年5月19日至2019年9月1日在宁夏朔牧盐池滩羊繁育有限公司进行。试验采用单因子随机试验设计，挑选体重[(24.42±1.53) kg]相近、健康的4月龄断奶滩羊公羔羊60只，随机分为4组，每组15只。对照组饲喂100%柠条饲料，试验1组饲喂75%柠条饲料+25%柠条发酵饲料，试验2组饲喂50%柠条饲料+50%柠条发酵饲料，试验3组饲喂25%柠条饲料+75%柠条发酵饲料。试验饲粮营养水平见表2。
表2 饲喂方案及试验饲粮营养水平(干物质基础)
1.2 柠条饲料的发酵
柠条饲料发酵采用湖南碧野生态农业科技有限公司生产的ZF型生物饲料发酵机，将配合好的柠条饲料(全混合日粮)原料加水搅拌均匀，使物料含水量达到55%左右，在75～80 ℃高温下2 h，然后再降温到40 ℃，加入预混料、发酵菌剂(乳酸菌+酵母菌+BY-H-Y复合菌剂)，在发酵罐内再搅拌2 h后出料，装入密闭的塑料袋，压实包装好，再在自然条件下让饲料在袋内发酵7 d后即可取料饲喂。
1.3 饲养管理
试验羊饲养条件一致，采用全舍饲饲养管理。10 d预试期，正试期104 d。预试期内对试验羊进行分组编号、圈舍清理和疫病防治。试验羊采用分圈混合饲喂的方式，饲喂前将柠条饲料与柠条发酵饲料按照表2中饲喂方案的比例混合后饲喂试验羊，每天早、晚各饲喂1次(08:30、16:30)，试验羊自由采食，自由饮水。正式试验开始时空腹称重，并记录；
试验期每隔30 d空腹称重，并记录，以便及时调整试验羊饲粮饲喂量；
试验结束时空腹称重，并记录，计算增重及平均日增重。
1.4 样品采集与处理
试验结束后，对照组与试验组随机选取试验羊3只，放血屠宰后剖开瘤胃，采集瘤胃液15 mL置于冻存管中，临时置于干冰上，采样结束后带回实验室，于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.5 样品测序
1.5.1 样品DNA提取与PCR扩增
采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取样本基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA的纯度及浓度，用于PCR扩增。将纯化质量合格、经过定量和均一化的PCR产物用于DNA文库构建，建库和测序分析。
知识产权转移转化对于军民融合发展战略和创新驱动发展战略的推动作用毋庸质疑，所带来的国防和经济价值增量也是毋庸质疑，未来必将是一片蓝海市场前景。笔者经过两年多理论和实践的探索，加之对知识产权转移转化广泛深入的调研，尝试“互联网+军民融合+知识产权+科技服务创新，建立军民融合知识产权转移转化平台。
1.5.2 测序
将样本送至北京百迈客生物科技有限公司运用PacBio测序平台进行16s rDNA测序，用于瘤胃微生物多样性分析。
1.6 数据处理与分析
数据通过Excel 2010初步整理后，采用DPS V9.01统计软件进行单因素方差分析，LSD多重比较法进行组间比较。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，P>0.05为差异不显著。
2.1 柠条发酵饲料对滩羊生长性能的影响
由表3可知，试验2组的终末体重、平均日增重最高，显著高于对照组(P<0.05)。
表3 柠条发酵饲料对滩羊生长性能的影响
2.2 柠条发酵饲料对滩羊瘤胃菌群多样性的影响
2.2.1 操作分类单元(OTU)数量
Venn图可以反映样品之间共有、特有的OTU数目，直接显示出样品间OTU的重合情况[6-7]。结合OTU所代表的物种，可以找出不同样本中的共有微生物。由图1可见，4个组总共产生了308个OTU，其中对照组产生了249个OTU，试验1组产生了151个OTU，试验2组产生了186个OTU，试验3组产生了216个OTU。4个组共享了78个OTU，占总OTU数目的25.32%。对照组、试验1组、试验2组和试验3组独有的OTU数目分别为32、5、3和25个，分别占总OTU数目的10.39%、1.62%、1.00%和8.12%。OTU数目顺序为对照组>试验3组>试验2组>试验1组，表明添加柠条发酵饲料降低了瘤胃内特有微生物的种类和多样性，但差异不显著(P>0.05)。
Group1、Group2、Group3、Group4分别代表对照组、试验1组、试验2组、试验3组。下图同。Group1，Group2，Group3 and Group4 represent control group, trial group 1, trial group 2 and trial group 3, respectively. The same as below.
2.2.2 Alpha多样性稀释分析
样品Alpha多样性指数稀释曲线见图2，其中横轴为测序数据量，纵轴为OTU数目，随着测序数据量的增加，OTU数目不再增加，即曲线趋于平缓，样品数据已饱和，表明测序深度可靠，能够真实反映样本中大多数微生物组成情况，足够进行菌群多样性分析。
A：OTU数量稀释曲线(97%相似度水平)；
B：Shannon指数稀释曲线(97%相似度水平)。
由表4可见，各组间ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数差异不显著(P>0.05)，其中试验2组的ACE和Chao1指数略高于对照组，说明试验2组中的物种数量多于对照组，添加50%柠条发酵饲料能够提高滩羊瘤胃的物种数量。
表4 Alpha多样性
2.2.3 Beta多样性分析
Beta多样性分析可以反映不同样品物种多样性的相似程度。采用加权unifrac的比较方法可以直观地反映出不同组别之间物种的组成结构差异性。各组之间距离越远，说明组间差异越大。本试验是为了比较不同柠条发酵饲料添加比例对滩羊生长性能和瘤胃微生物区系的影响，故此采用加权unifrac的方法进行比较分析。由图3可以看出，4个组的主坐标分析(PCoA)和非度量多维标定法(NMDS)相距较远，说明各组瘤胃微生物区系存在差异，也进一步说明添加柠条发酵饲料可以使滩羊瘤胃微生物菌群结构发生改变。
A：基于16S rDNA的PCoA；
B：基于16S rDNA的NMDS分析。
2.3 瘤胃菌群组成和结构分析
2.3.1 门(phylum)水平菌群组成和结构分析
门水平上滩羊瘤胃菌落组成和相对丰度见图4和表5，共检出14个菌门，其中4个组中滩羊瘤胃液中的优势菌门主要为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、Kiritimatiellaeota、Patescibacteria、软壁菌门(Tenericutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)和变形菌门(Proteobacteria)，占到了总细菌数的99%以上。与对照组相比，试验1组滩羊瘤胃液中变形菌门的相对丰度显著提高(P<0.05)，厚壁菌门和Patescibacteria的相对丰度显著降低(P<0.05)；
试验2组滩羊瘤胃液中厚壁菌门的相对丰度显著提高(P<0.05)，Patescibacteria和变形菌门的相对丰度显著降低(P<0.05)；
试验3组滩羊瘤胃液中变形菌门相对丰度显著提高(P<0.05)，拟杆菌门的相对丰度有提高的趋势，与其他各组差异不显著(P>0.05)。综上可见，试验2组即添加50%的柠条发酵饲料可以显著提高滩羊瘤胃液中优势菌门厚壁菌门的相对丰度，显著降低了Patescibacteria和变形菌门的相对丰度。
Firmicutes：厚壁菌门；
Bacteroidota：拟杆菌门；
Proteobacteria：变形菌门；
Tenericutes：软壁菌门；
Planctomycetes：浮霉菌门；
Verrucomicrobia：疣微菌门；
Actinobacteria：放线菌门；
Euryarchaeota：广古菌门；
Others：其他。
表5 柠条发酵饲料对滩羊瘤胃菌群在门平上相对丰度的影响
2.3.2 属(genus)水平菌群组成和结构分析
属水平上滩羊瘤胃细菌组成和相对丰度见图5和表6，4组滩羊瘤胃液中菌群总共包含80个属，其中相对丰度排名前10的菌门分别为Others、解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、普雷沃菌属_1(Prevotella_1)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、普雷沃菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、牛月形单胞菌(Selenomonas)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、巨球形菌属(Megasphaera)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)等。与对照组相比，试验1组滩羊瘤胃液中巨球形菌属和琥珀酸弧菌属相对丰度显著高于对照组(P<0.05)，解琥珀酸菌属、瘤胃球菌属、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、普雷沃菌科UCG-001和理研菌科RC9肠道群的相对丰度显著降低(P<0.05)；
试验2组瘤胃液中解琥珀酸菌属和普雷沃菌属_1的相对丰度显著升高(P<0.05)，其余细菌属相对丰度有升高或者降低的趋势，但差异都不显著(P>0.05)；
试验3组瘤胃液中普雷沃菌科UCG-001和瘤胃球菌属的相对丰度显著降低(P<0.05)，其余细菌属相对丰度有升高或者降低的趋势，但差异都不显著(P>0.05)。综上可见，试验2组即添加50%的柠条发酵饲料可以显著提高滩羊瘤胃液中解琥珀酸菌属和普雷沃菌属_1的相对丰度(P>0.05)。
Succiniclasticum：解琥珀酸菌属；
Prevotella_1：普雷沃菌属_1；
Prevotella: 普雷沃菌属；
Ruminococcus：瘤胃球菌属；
Selenomonas：牛月形单胞菌；
Succinivibrio：琥珀酸弧菌属；
Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃菌科_UCG-001；
Megasphaera：巨球形菌属；
Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9肠道群；
Others：其他。
表6 柠条发酵饲料对滩羊瘤胃菌群在属水平上相对丰度的影响
有研究表明，柠条加工后适用于牛、羊等反刍动物生长中的育肥阶段，可以加快动物生长发育的速度，明显缩短育肥期[8]。同时大部分研究表明，微生物发酵可以提高饲料营养价值、改善饲料的适口性，增加有益的代谢产物，维持肠道菌群平衡，提高免疫力、饲料的利用效率以及畜禽的生产性能和肉品质等，具有极其广阔的应用空间[9]。王晓飞等[10]研究表明，利用膨化秸秆微生物发酵饲料饲喂杜寒杂交肉羊能够极显著提高肉羊的采食量和日增重。这可能因为膨化秸秆微生物发酵饲料的纤维结构发生改变，有利于消化利用率的提高，促进了胃肠道的发育，使试验组羔羊日增重大幅提高。此外，还有研究表明，微生物发酵饲料能够提高乐至黑山羊生长性能，山羊精料中添加50%的微生物发酵饲料，可提高乐至黑山羊日增重，提高经济效益，具有推广应用价值[11]。马吉锋等[12]研究表明，饲粮中添加15%的柠条可以显著提高滩羊日增重。李爱华等[13]用柠条草粉在枯草期补饲滩羊，极显著提高了滩羊的平均日增重。本研究利用微生物菌剂对柠条饲料进行发酵处理后与未发酵的柠条饲料进行混合后饲喂滩羊，试验2组与对照组相比，显著提高了终末体重、平均日增重，与上述试验结果一致。
瘤胃是反刍动物的消化器官，是一个天然的发酵罐，内含多种微生物，包括细菌、真菌、原虫和古菌等。瘤胃能利用纤维和非蛋白氮等物质，生成挥发性脂肪酸和某些含氮物质，以及利用碳氮源合成微生物蛋白，帮助动物体内营养物质的转化[14-15]。众多研究结果表明，反刍动物瘤胃中的厚壁菌门和拟杆菌门是主要的优势菌群，其在瘤胃发酵过程中具有十分重要的作用[16-17]。周俊华等[18]研究了不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃微生物群落的影响，研究结果表明努比亚山羊瘤胃中优势菌群依次为拟杆菌门和厚壁菌门。赵梦迪等[19]测定结果表明拟杆菌门为湖羊瘤胃第一优势菌。冯肖然等[20]进行了羊瘤胃优势菌组成的Meta分析，结果表明羊瘤胃细菌群落组成中的优势菌种依次为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门。金鹿等[21]研究了沙蒿多糖组合制剂对滩羊羔羊瘤胃菌群多样性的影响，其研究结果表明，滩羊瘤胃中优势菌群按照相对丰度由大到小依次为厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。本试验研究结果显示，优势菌群按照相对丰度由大到小依次为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，这个结果与上述研究结果一致。
滩羊瘤胃液中优势菌门是厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。有研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门二者数量的比例会影响机体对能量的吸收；
而且两者的比例对发酵多糖也很重要，拟杆菌门数量降低或厚壁菌门数量增加都有助于促进脂肪吸收累积[22-23]。有研究表明，肥胖者肠道菌群中拟杆菌门、厚壁菌门的比例较之身体质量正常者明显降低，厚壁菌门和拟杆菌门存在一种相互促进的共生关系，它们共同促进宿主吸收或储存能量[24]。这可能是因为厚壁菌门细菌富含淀粉、半乳糖及丁酸等代谢酶，有助于促进机体对能量的吸收，更有利于脂肪的沉积[25]。张孟阳等[26]研究了发酵饲料对仔鸡肠道微生物群落多样性影响，结果显示发酵饲料组厚壁菌门相对丰度远大于非发酵饲料组，说明饲喂发酵饲料显著增加了厚壁菌门的相对丰度(乳杆菌属为厚壁菌门)。本试验中，试验2组厚壁菌门相对丰度明显增加，有助于滩羊羔羊的生长和发育，促进增重，正好解释了试验2组羔羊生长性能最高的原因。
普雷沃菌属是瘤胃中优势菌属，普雷沃菌属是主要的蛋白质降解菌之一，可降解瘤胃中蛋白质和淀粉等高分子物质[27]，在蛋白质、淀粉、木聚糖和果胶的降解过程中发挥着重要作用[28-29]。Koike等[30]研究发现，在苜蓿干草型饲粮饲喂下，绵羊瘤胃产琥珀酸丝状杆菌相对白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌数量更高，具有很高的纤维素降解能力，可以把瘤胃球菌不能降解的晶体纤维素降解，因此解琥珀酸菌属中产琥珀酸丝状杆菌被认为是黏附在饲粮纤维成分上的活性最强的纤维素降解菌。同时还有研究结果表明，产琥珀酸丝状杆菌具有独立的纤维素化区和结合区的酶，可以分解纤维，并且还能分解黄白瘤胃球菌[31]。本试验研究表明，除了Other菌群外，解琥珀酸菌属、瘤胃球菌属和普雷沃菌属_1是滩羊瘤胃中的优势菌种，而其中试验2组中的解琥珀酸菌属和普雷沃菌属_1的相对丰度最高，说明添加50%柠条发酵饲料可以显著增加厚壁菌门、解琥珀酸菌属和普雷沃菌属_1的相对丰度，从而增加了纤维素的降解吸收，增加了终末体重，提高了平均日增重。
综上可见，饲粮中添加柠条发酵饲料虽然不能提高滩羊羔羊菌群多样性，但可以显著增加厚壁菌门、解琥珀酸菌属和普雷沃菌属_1的相对丰度，从而提高终末体重，且以试验2组添加50%柠条发酵饲料的育肥效果最好。
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