何艺宾，刘 杰，郝 华，彭 会*
（1.厦门海洋职业技术学院 海洋生物学院，福建 厦门 361100；
2.厦门大学海洋生物制备技术国家地方联合工程实验室，福建 厦门 361104）
江蓠（Gracilaria）是一种重要的大型海洋经济藻类，其富含藻胶,是琼脂提取的主要原料[1-2].据报道，琼脂提炼工厂每年大约消耗72 300 t（干重）富含藻胶的植物原料，生产9 600 t 琼脂，能够创造大约17 300万美元的经济价值[3].随着经济的不断发展，琼脂的需求量逐年增加，天然产的江蓠已经无法满足人们的需求，亟需进行大规模的江蓠人工养殖.但由于江蓠在人工养殖过程中容易出现藻种老化、藻体染病等问题，其人工大规模养殖受到严重阻碍[4].利用分子基因工程技术对江蓠藻种进行品种改良是解决当前江蓠人工养殖所产生问题的有效途径之一.但目前江蓠基因工程的研究远远落后于其他大型海洋经济藻类,如紫菜(Porphyra)等[5]，除Gan 等[6]利用基因枪在张氏江蓠（Gracilaria changii）中获得lacZ基因的瞬时表达研究外，有关江蓠转基因技术方法的报道也较为罕见.
农杆菌介导的转化方法具有操作简单、可转移大片段DNA、插入基因整合拷贝数低、遗传稳定性好、重排少和可优先整合到转录活性区等优点，已成为当前植物基因工程最常用的方法[7].杨泽熵等[8]利用农杆菌介导的方法在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中表达外源酵母菌gpd1基因；
覃晓云等[9]建立了农杆菌介导地莱茵衣藻转化体系.鉴于此，本研究以细基江蓠繁枝变种（Gracilaria tenuistipitatavar.liui Zhang et Xia）类愈伤组织为受体材料，采用杆菌介导的方法建立细基江蓠繁枝变种转化体系，旨在为江蓠品种的遗传改良提供参考.
1.1 实验材料
供试材料：细基江蓠繁枝变种，采集自福建东山岛杏陈镇.
主要实验试剂：乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、潮霉素B、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、激动素（kinetin，KT）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4-D）均购自Sigma公司.
1.2 细基江蓠繁枝变种类愈伤组织的诱导
步骤1：用软毛刷去除细基江蓠繁枝变种藻体表面的沙泥等杂物[10]，并用无菌海水清洗3遍，然后置于25‰无菌海水（含200 mg·L-1卡那霉素）中培养2 d，培养条件为25 ℃，120 μmol·photons·m-2·s-1，光照周期L∕D=12∕12.
步骤2：选取步骤1 中培养的健康生长的藻体，摘取中间部位外植体4～5 cm（介于顶端和主干之间），用无菌海水清洗3 遍，将清洗后的外植体切成1～2 cm 大小，置于1.5%碘化钾溶液中浸泡10 min，取出后用无菌海水清洗3遍，然后分别用含有不同激素组合的培养液暗培养21 d（培养温度20 ℃）.暗培养结束后，分别观察并统计不同实验组的类愈伤组织诱导率.具体的激素组合包括组合1（25‰MES 培养液添加20 μmol·L-1MeJA、0.5 mg·L-1KT、2.0 mg·L-12,4-D、200 mg·L-1卡那霉素）和组合2（25‰MES培养液添加20 μmol·L-1MeJA、0.5 mg·L-1KT、1.5 mg·L-12,4-D、200 mg·L-1卡那霉素）.
1.3 农杆菌EHA105介导外源gfp基因转化类愈伤组织
用接种环挑取农杆菌EHA105（携带植物双元表达载体pMDC85-Gfp 质粒DNA）单菌落，接种于5 mL 含50 mg·L-1卡那霉素、50 mg·L-1利福平的LB 液体培养基（25‰海水配制）中，置于28 ℃，200 r·min-1条件下培养过夜.隔天按1%～2%的比例将前一天培养的菌种接种到新鲜的LB 培养基（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μ mol·L-1AS、25‰海水配制）中，振荡培养，进行二次活化.测定细菌培养液在600 nm 处的吸光值，当OD600为0.4～0.5时，进行6 500 r·min-1离心处理5 min，收集菌液于无菌离心管中，用等体积的25‰无菌海水（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μmol·L-1AS）重悬.将方法1.2处理获得的类愈伤组织接种到农杆菌重悬菌液（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μmol·L-1AS）中，抽真空15 min，25 ℃,避光培养48 h.
培养48 h 后，将类愈伤组织置于含500 mg·L-1羧苄青霉素、200 mg·L-1卡那霉素的25‰无菌海水中浸泡30 min，然后用25‰无菌海水清洗3遍，清洗后置于荧光显微镜（Axio Scope A1，德国ZEISS）下观察类愈伤组织转化子中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)报告基因的表达情况.
1.4 转化子PCR鉴定
分别选取GFP 绿色荧光检测阳性的转化子和野生型类愈伤组织（约10 mg），置于1.5 mL Eppendorf离心管中，用手持式匀浆研磨仪迅速将类愈伤组织研磨成匀浆，加入400 μL DNA 提取液（200 m mol·L-1Tris-HCL（pH 8.0）、250 mmol·L-1NaCL、25 m mol·L-1EDTA，0.5%SDS，高压灭菌后使用），剧烈摇动混匀后，12 000 r·min-1离心2 min，取上清液300 μL 加入到另一个1.5 mL Eppendorf 离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后于室温下静置2 min，然后12 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，并室温放置15 min，然后加入50 μL ddH2O 使沉淀完全溶解，即得到DNA 粗提液.分别取1 μL 基因组DNA 为模板，以引物GF:5′-GGA GAA GAA CTT TTC ACT GG-3′和引物GR：5′-GTT CAT CCA TGC CAT GTG TA-3′为扩增引物，用东盛生物2×Hs Taq mix进行PCR鉴定.
PCR 扩增体系（25 μL）：1 μL 模板DNA,1 μL 引物GF（10 μ mol·L-1）,1 μL 引物GR（10 μmol·L-1）,12.5 μL 2×Hs Taq mix,9.5 μL ddH2O.PCR 扩增条件：95 ℃5 min，95 ℃1 min,55 ℃45 s,72 ℃1 min,72 ℃10 min,30个循环.
2.1 细基江蓠繁枝变种类愈伤组织的诱导结果
外植体分别在2 种不同植物激素组合的培养液中暗培养21 d 后，观察发现，2 种不同植物激素组合的培养液均能诱导出透明的类愈伤组织，且组合1 的类愈伤组织诱导率好于组合2，组合1 的类愈伤组织诱导率高达56.98%（表1），且其诱导出的类愈伤组织位于外植体顶端（图1）.
图1 组合1诱导获得的细基江蓠繁枝变种类愈伤组织
表1 细基江蓠繁枝变种类愈伤组织的诱导率统计表
2.2 农杆菌EHA105介导的外源gfp基因转化类愈伤组织
由图2 可知,类愈伤组织与农杆菌EHA105 培养48 h 后在荧光显微镜中观察发现：类愈伤组织转化子表面可见数量不等的发绿色荧光的小斑点，即为表达gfp基因的转基因组织，而对照组类愈伤组织中未能检测到GFP 绿色荧光.实验结果表明，农杆菌EHA105 介导法可实现外源gfp基因在类愈伤组织中的表达，植物双元表达载体pMDC85-Gfp质粒DNA 表达框架如图3所示.
图2 转基因类愈伤组织的GFP荧光检测结果
图3 植物双元表达载体pMDC85-Gfp质粒DNA表达框架
2.3 转化子PCR鉴定结果
随机选取2个GFP 绿色荧光检测阳性的转化子进行PCR 鉴定，实验结果表明，外源gfp基因在农杆菌EHA105的介导下成功地整合到细基江蓠繁枝变种类愈伤组织的基因组DNA中.如图4所示，泳道1、2 为随机选取的2 个转化子基因组DNA PCR 产物电泳结果，2 个泳道中均出现单一的条带，且条带大小与gfp基因大小一致，而对照组野生型类愈伤组织基因DNA PCR产物电泳结果中未见目的条带.
图4 转化子PCR鉴定结果
在高等植物的组织培养中，通常使用植物激素来诱导愈伤组织的形成并促进其生长与分化.通常只需单独使用2,4-D就能成功地诱导出植物愈伤组织，其使用的工作浓度介于0.001～10 mg·L-1.然而在海藻组织培养中，植物激素是否能促进其生长，是长期以来在藻类学界中有争议的问题[11].迄今为止，植物激素对细基江蓠繁枝变种愈伤组织诱导的影响尚未见报道.课题组前期的研究发现，MeJA 对细基江蓠繁枝变种外植体的生长具有促进作用，最佳使用浓度为20 μ mol·L-1.本研究中利用3种植物激素的不同组合，成功地诱导出了细基江蓠繁枝变种愈伤组织.由此可见，植物激素对江蓠类愈伤组织的诱导具有促进作用.
本研究首次报道采用农杆菌EHA105介导方法实现了外源gfp基因在江蓠类愈伤组织中的表达.农杆菌EHA105主要用于高等单子叶植物的遗传转化，通过与愈伤组织共培养的方式侵染愈伤组织，从而实现外源基因的遗传转化.因此，农杆菌EHA105能否在海水培养基中生长且具有侵染力是影响转基因成败的关键因素之一.
综上，细基江蓠繁枝变种外植体的类愈伤组织可作为受体材料，采用农杆菌介导法可实现外源gfp基因在类愈伤组织中的表达，可为江蓠品种的遗传改良提供参考.
猜你喜欢卡那霉素变种外源具有外源输入的船舶横摇运动NARX神经网络预测舰船科学技术(2022年11期)2022-07-15避免污名化！世卫组织改用希腊字母命名变异新冠病毒意林·作文素材(2021年15期)2021-10-08中国环境科学研究院外源污染过程与控制研究室农业资源与环境学报(2021年5期)2021-10-06多油辣木PKM-1卡那霉素耐受性研究西南农业学报(2021年4期)2021-05-25变种队的复仇之路学生天地(2019年33期)2019-08-25外源钙对干旱胁迫下火棘种子萌发的影响现代园艺(2018年3期)2018-02-10头孢霉素与卡那霉素对花生组培苗生根的影响山东农业科学(2017年8期)2017-09-09外源添加皂苷对斑玉蕈生长发育的影响上海农业学报(2017年3期)2017-04-10奇妙变种人小学生导刊(高年级)(2016年4期)2016-04-08非洲紫罗兰组培体系中卡那霉素的抗性筛选江苏农业科学(2015年8期)2015-09-10