王丽娜 王海
人卵母细胞生长、发育是一个错综复杂的生理、生化演变过程，经历了卵原细胞、初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟卵母细胞4 个生长发育阶段。初级卵母细胞经过第一次减数分裂，排出第一极体，成为次级卵母细胞。次级卵母细胞经过第二次减数分裂，发育成为成熟卵母细胞，即MⅡ[1]。这两次成熟分裂能整合多种信号和诸多因子，这些信号通路和诸多因子构成了卵母细胞生长发育的调控网络。尽管如此，一些机制仍不清楚，一些信号通路仍未发现，参与这一过程的细胞因子功能和作用尚未被完全证实。故深入研究人类卵母细胞生长、发育及这一过程中的生理调控机制，对人类生殖医学及其临床应用方面具有重要意义。
卵原细胞没有“住”在卵泡内，当雌性胚胎发育到8～10 周龄时，性腺组织出现卵巢结构，迁移到卵巢的原始生殖细胞通过有丝分裂进行增殖。到妊娠12 周龄时，胎儿卵巢内的生殖细胞达到60 000个子细胞，这些细胞称之为卵原细胞。
而初级卵母细胞“住”在卵泡内，从妊娠16 周龄开始，卵原细胞失去了进一步增殖有丝分裂能力，开始了第一次减数分裂，此时细胞称为初级卵母细胞，这些细胞仅发育到第一次减数分裂前期的双线期就停滞下来。与此同时，这些初级卵母细胞与其周围单层扁平的颗粒细胞被一薄基底膜包裹，形成原始卵泡[2]。当胎儿20～24 周龄时，几乎所有的卵原细胞全部发育到第一次减数分裂的前期双线期，约为600 万～700 万个。卵原细胞长期停滞在第一次减数分裂前期双线期，直到青春期受性激素的刺激时才恢复减数分裂，短者需要12年后恢复，长者需要50 年。尽管初级卵母细胞核停滞在分裂前期双线期，但并没有停止生长，卵母细胞随着卵泡生长而生长，卵胞质内的物质在不断地积累和丰富。
卵泡的发育与卵母细胞生长相对应，通过观测卵泡的发育可以推测卵母细胞生长阶段。初级卵泡到早期三级卵泡阶段独立于FSH 刺激，主要通过旁分泌和自分泌方式进行生长发育[3]。卵泡发育到有腔卵泡阶段，FSH 可促进卵泡发育，经过选择，只有一个卵泡发育生长成优势卵泡，在促性腺激素LH 作用前，卵母细胞一直滞留在生发泡（GV）阶段。卵母细胞的发育能力是在卵泡生长、发育过程中逐渐获得的[4]：①卵泡直径超过5mm，卵母细胞具备了发生GVBD 的能力；
②卵泡直径超过8mm，卵母细胞具备发育到MⅡ的能力；
③卵泡直径超过11mm，卵母细胞具备了维持早期胚胎发育的能力；
④卵泡直径超过14mm，卵母细胞核、质均成熟，在LH 作用下，恢复减数分裂Ⅰ，发育到减数分裂Ⅱ中期，即MⅡ，此时卵母细胞具备了受精和维持胚胎全程发育的能力（图1，出自参考文献4）。
图1 体内卵泡和卵母细胞发育阶段的相互关系
卵母细胞由初级卵母细胞分裂变成次级卵母细胞的过程中，卵母细胞停滞于第一次减数分裂前期双线期，即GV 期，但这种停滞的确切分子机理至今仍未完全清楚，这种停滞状态可能受激素、大量调节因子和多条信号通路等多种因素影响，目前认为这种减数分裂的活动停滞是由来自卵泡内膜、颗粒细胞和卵泡液的多种抑制物共同作用的结果，有些抑制物主要通过缝隙连接进入卵母细胞内起作用（图2A、B）。
图2 卵母细胞减数分裂I 停滞与恢复的信号通路
目前，抑制卵母细胞减数分裂的抑制物（Oocyte maturation inhibitor，OMI）尚未完全清楚，推测是一些肽类分子（如转化生长因子，TGF-）、抗苗勒氏管激素（AMH）、激活素、抑制素或卵泡抑制素、卵泡液中的次黄嘌呤和环磷酸腺苷（cAMP）[5]等，在这些抑制物中，研究较多且比较清楚的是cAMP。
目前，认为维持卵母细胞减数分裂Ⅰ双线期停滞状态主要是通过维持卵母细胞内cAMP 高水平来实现的[6]。cAMP 进入卵母细胞后，维持成熟促进因子（Maturation promoting factor，MPF）的非活性状态，失活的MPF 导致卵母细胞阻滞在第一次减数分裂Ⅰ前期的双线期，直到LH 峰的出现。cAMP有两个来源：一个是颗粒细胞合成的cAMP，通过缝隙连接扩散到卵母细胞内（图2A）：另一个是哺乳动物卵母细胞本身能够产生足够多的cAMP[7]。颗粒细胞cAMP 产生过程：配体与G 蛋白偶联受体（GPCR）结合，导致Gs 蛋白激活，进而激活颗粒细胞中腺苷环化酶（AC），在AC 的作用下，促使三磷酸腺苷（ATP）转变成cAMP，cAMP 通过颗粒细胞和卵母细胞之间的缝隙连接转移到卵母细胞内[8]。在卵母细胞内，同样Gs 通过表达在卵母细胞膜表面的G 蛋白偶联受体的激活，刺激AC 合成内源性cAMP（图2B），颗粒细胞源源不断地输送cAMP 到卵母细胞内和卵母细胞自身产生cAMP，维持着卵母细胞的cAMP 高水平状态。另外，颗粒细胞生成的cGMP 通过缝隙连接进入卵母细胞内，cGMP 降低卵母细胞内PDE3 活性，减少cAMP 降解，进一步维持卵母细胞内cAMP 高浓度状态，抑制减数分裂Ⅰ的恢复（图2B）。
cAMP 通过cAMP-PKA-MPF 信号途径发挥作用。MPF 是一种复杂的异源二聚体，由一个催化亚基CDKI 和调控亚基CyclinB1 组成，CDK1 激酶是一个维持或诱导卵母细胞减数分裂Ⅰ停滞与恢复的中心因子[9]。胞质内高水平cAMP 通过cAMPPKA-MPF 信号途径，促使Cdc25 失活，激活Wee1/Myt1。活化的Wee1/Myt1 促使MPF 的催化亚基CDKI 上的丝氨酸及苏氨酸残基磷酸化，Thr-14、Tyr-15 和Thr-161 三个氨基酸位点被磷酸化，其中，Thr-14 和Tyr-15 位点磷酸化有抑制MPF 活性的作用，而Thr-161 位上点磷酸化是MPF 活性的必需条件。磷酸化的CDKI 与调控亚基cyclinB 结合，致使MPF 处于稳定、无活性状态，从而使卵母细胞停滞在减数分裂Ⅰ前期的双线期[10]。可见，MPF 处于无活性状态是减数分裂Ⅰ停滞于双线期的关键因素（图2B）。
卵母细胞停滞于第一次减数分裂前期双线期，细胞核处于相对静止状态，但卵母细胞本身和它所在的卵泡生长并未停止。卵泡体积在增大，卵泡液内的物质在不断积累。随着卵泡的生长发育，卵母细胞体积随之增大，胞浆内物质更为丰富，当卵母细胞直径达到95～120μm 时[11]，具备了生发泡破裂（Germinal vesicle break down，GVBD）的能力。GVBD 是减数分裂Ⅰ恢复的形态学标志。
在自然情况下，卵母细胞恢复减数分裂Ⅰ，必须具备以下条件：①卵泡直径>5mm[4]；
②卵母细胞体积达到成熟体积的80%以上[11]；
③促性腺激素的诱导。具备了前两个条件，在促性腺激素LH 的诱导下，才能启动停滞于双线期的减数分裂Ⅰ。卵母细胞从胚胎期到青春期前，维持减数分裂Ⅰ停滞状态，普遍认为主要是通过保持cAMP 高浓度来实现的。卵母细胞内cAMP 浓度主要是由颗粒细胞进入卵母细胞内的cAMP 和卵母细胞自身生成/降解cAMP 来维持的。当减数分裂Ⅰ处于停滞状态，三者保持动态平衡，维持卵母细胞内cAMP 高水平状态。一旦在某些因素影响下，三者平衡被打破，卵母细胞内cAMP 的浓度下降，PKA 信号途径失活，导致Cdc25 活性上升，促使Cdk1 上的Thr14 和Tyr15 去磷酸化，激活MPF，激活的MPF 启动了停滞于双线期的减数分裂Ⅰ。在促性腺激素LH 作用下，降低cAMP 浓度的途径包括：
3.1 LH 提高PDE 活性，降低颗粒细胞和卵母细胞内cAMP 水平PDE 蛋白家族有着多种不同亚型，一种专门负责降解第二信使cAMP 和cGMP 的酶。在颗粒细胞内主要存在着PDE4，在卵母细胞内主要存在着PDE3。
在颗粒细胞中，LH 峰出现，细胞内Ca2+储存的释放，激活了蛋白激酶C（PKC）信号途径，提高了颗粒细胞内PDE4 活性，促使cAMP 水解，使从颗粒细胞进入卵母细胞内的cAMP 减少。
Norris 等研究发现，LH 峰的出现降低了卵泡壁层颗粒细胞内NPPC 的含量和卵丘细胞上NPR2 的活性，造成cGMP 合成减少（cGMP 是PDE3 的竞争性抑制剂），从颗粒细胞进入卵母细胞内的cGMP 相应的减少，降低了cGMP 对磷酸二酯酶PDE3 活性的抑制效应，致使PDE3 活性增强，导致卵母细胞内cAMP 水平下降[12，13]。
Xi 等[14]进一步发现，LH 依赖EGFR-ERK1/2信号通路，激活转录因子EGR1 的表达和ELK1的磷酸化，从而迅速上调卵泡壁层颗粒细胞中的TTP 蛋白水平。TTP 蛋白通过靶向至NPPC mRNA 3’UTR 区域独特的非经典AU 富集元件（noncanonical ARE），引发NPPC mRNA 快速降解和C-型钠肽快速下降，提高卵母细胞中PDE3A 的活性，降低卵母细胞中cAMP 水平，从而保证卵子减数分裂重新启动的正常进行。
总之，在LH 作用下，PDE4、PDE3 活性增强，降低了颗粒细胞、卵母细胞内cAMP 水平，致使PKA 信号途径失活，激活cdc25 磷酸酶，使MPF 去磷酸化激活，卵母细胞启动减数分裂Ⅰ（图2C）。
3.2 LH 激活MOS-MEK-MAPK 信号途径LH 激活MOS-MEK-MAPK 信号途径，促使cAMP 降解，引起颗粒细胞与卵母细胞缝隙连接的阻断在卵母细胞内，LH 诱导MOS 水平升高（MOS 是原癌基因c-mos 的产物，是生殖细胞特异性Ser/Thr 激酶）[15]，MOS 诱导MEK 磷酸化并由此产生活性，然后MEK激活MAPK 信号通路，促使cAMP 降解。有报道在牛的卵母细胞成熟过程中，向胞质内注射MOS 的mRNA，激活了MAPK，引发cAMP 水平下降和减数分裂启动[16]。同样，在颗粒细胞内，存在的MOSMEK-MAPK 信号途径被LH 激活后，促使颗粒细胞内的 cAMP 降解，从颗粒细胞进入卵母细胞内的cAMP 相应地减少（图2C）。可见，MAPK 信号途径是卵母细胞减数分裂Ⅰ恢复的关键因素之一。
LH 激活MOS-MEK-MAPK 信号途径，诱导Cx43 上的丝氨酸残基磷酸化[17]，磷酸化Cx43 阻断了卵母细胞和颗粒细胞之间的缝隙连接，致使外部的cAMP 无法进入卵母细胞。同样，阻止了cGMP进入卵母细胞，cGMP 浓度下降导致了PDE3 活性恢复，促进cAMP 水解[18]。实验证明，在大鼠卵泡培养中添加LH，间隙连接蛋白CX43 磷酸化，使卵母细胞发生GVBD[19]。
3.3 LH 激活PLC-IP3/DAG-PKC 信号途径，降低卵母细胞内cAMP 水平在LH 作用下，磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）分解产生肌醇三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）两个第二信使分子，二者有着不同信号途径的重要第二信使，也是合成其他重要信号分子的底物。IP3 作为可溶性结构释放到胞质溶胶中，与内质网膜上专一的IP3 受体（IP3 receptor）结合，使IP3-门控Ca2+通道打开，使Ca2+从内质网释放出来，进入细胞质内，导致细胞质中Ca2+浓度增加[20～23]。Ca2+和DAG 一起激活PKC，提高PDE 活性，促使cAMP 降解，卵母细胞内cAMP 水平随之下降（图2C）。
卵母细胞恢复减数分裂Ⅰ，完成减数分裂Ⅰ后，就停滞在减数分裂Ⅱ中期（MⅡ）。MⅡ的停滞有助于卵母细胞的核质成熟同步化，等待受精，是哺乳动物在进化过程中获得的一种重要生理机制。MⅡ停滞是以维持高活性MPF 和中期纺锤体稳定为特征，但卵母细胞为何会停滞在MⅡ仍处于探索和研究之中。目前认为这种停滞主要依赖静止因子（Cytostatic factor，CSF），CSF 不是一种特定因子，而是多种蛋白激酶复合物，迄今为止还没有完全认识CSF。现在已知的信号途径参与MⅡ停滞见图3。其中Mos-MEK-MAPK-Rsk 信号途径是CSF 不可缺少的成分，科学家们把上游的Mos 和下游的Rsk注射到二细胞胚胎卵裂球，均会导致细胞分裂停滞在中期。
图3 Mos-MAPK 通路和EmiZ-APC/C 通路维持卵母细胞MⅡ稳定性
进一步研究表明Mos-MEK-MAPK-Rsk 通路是通过阻止CyclinB 降解，激活和维持MPF 处于高活性状态，来阻止MⅡ卵母细胞进一步发育[24]。同时，MAPK 激活MISS（MAPK-interacting and spindlestabilizing protein）和DOC1R（Deleted in oral cancer-1 related），活化的MISS 和DOC1R 对纺锤体有稳定作用。MISS 或DOC1R 缺失将会导致微管星体的延长，或导致MⅡ期纺锤体紊乱，通常表现为纺锤体两极中的一极缺失。
EmiZ（Endogenous meiotic inhibitor Z）也是CSF的成分之一，通过抑制APC/C（Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome）的活性，致使CyclinB 累积，致使MPF 处于高活性状态，阻止MⅡ向后期转变[25]。当精子遇到卵子发生顶体反应后，CSF 的活性随着卵母细胞受精而消失[26]。同样，MPF 的活性是在受精后1.5h 完全消失，其活性下降过程与卵母细胞第二次减数分裂恢复的过程同步。
成熟卵母细胞是指能接受精子受精并能形成正常发育胚胎的卵母细胞。不同种类动物卵母细胞是在不同发育阶段达到该状态，有的是在GV 破裂之前，即处于初级卵母细胞时期，如蛔虫、箭虫；
有的处于减数分裂Ⅰ中期，如贻贝、玻璃海鞘；
有的是在减数分裂Ⅱ中期（MⅡ），如绝大多数脊椎动物；
有的已完成二次成熟分裂，如腔肠动物。人的成熟卵母细胞是在MⅡ，此时卵母细胞能接受精子受精并能形成正常发育胚胎。
卵母细胞成熟是一个复杂过程，包括核成熟和卵胞质成熟，这两个方面相辅相成，任何一方出现问题都会影响卵母细胞成熟和进一步受精和发育。
5.1 卵母细胞的核成熟人卵母细胞成熟起始于胚胎期，完成于性成熟后。卵母细胞核成熟在形态学上的标志表现为GVBD 和第一极体（The first polar body，PBI）排出。
当胎儿发育到24 周龄时，几乎所有的卵原细胞进入第一次减数分裂，成为初级卵母细胞。初级卵母细胞经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期，在此停滞发育，并与原始颗粒细胞相互作用形成了原始的卵泡。初级卵母细胞停滞在双线期长达十几年到五十多年。此时，细胞核较大，称之为GV，GV 有一层清晰、完整的核膜包裹着，在其内部靠近核膜有一核仁。
从原始卵泡阶段的卵母细胞到早期有腔卵泡阶段的卵母细胞，其核功能逐渐被激活。染色质解聚呈高度疏松状，核膜和核仁清晰可见（核仁是由致密纤维组分、纤维中心和颗粒组分构成的纤维网状结构，其间有许多空泡，空泡可能与核仁物质运输和贮存有关），待空泡逐渐消失，核仁也逐渐致密化，核糖体RNA（rRNA）在核仁中合成、储存[27]。核仁完全致密化、核仁周围有染色质相伴分布是减数分裂恢复的必要条件[28，29]。
青春期后，在促性腺激素调控下，染色体扩散，高度凝集在核膜内缘，核孔复合体随之消失，随后发生核膜破裂，核内物质与胞质混合，此过程被称为GVBD，标志着减数分裂Ⅰ恢复。当排出第一极体，卵母细胞完成了第一次减数分裂，很快进入减数分裂Ⅱ，并停滞在MⅡ期，至此卵母细胞完成核成熟。核成熟的卵母细胞内藴藏着大量与受精和胚胎发育分化相关的信息。
5.2 卵母细胞的胞质成熟在卵母细胞完成核成熟的过程中，细胞质随之发生许多与成熟相关的变化，但胞质成熟形态改变不像核成熟那样明显且易观察。目前，学术界认为细胞质成熟主要包括：皮质颗粒的增多与迁移、各种细胞器迁移与分布以及卵膜和透明带之间的变化等，这些变化被作为衡量细胞质成熟的指标。
5.2.1 皮质颗粒（Cortical granules，CGs）的变化 在卵母细胞成熟的过程中，皮质颗粒数量在不断增加，分布也在发生规律性变化。皮质颗粒的合成是个持续的过程，但高尔基体合成、分泌皮质颗粒呈现出两个高峰期：第1 次发生在小腔卵泡的卵母细胞内；
第2 次发生在即将恢复减数分裂Ⅰ的卵母细胞内[30，31]。在卵母细胞成熟过程中，一方面高尔基体在不停地合成皮质颗粒，与此同时皮质颗粒向卵子边缘迁移；
另一方面随着卵母细胞成熟，高尔基体在逐渐消失，成熟的卵子内没有高尔基体，表明成熟的卵子已完成了皮质颗粒细胞合成。按照皮质颗粒迁移的规律而言，未成熟卵母细胞的CGs 主要分布在皮质区，而成熟卵母细胞的CGs 是在质膜下呈单层排列[31，32]。由此可见，皮质颗粒数量增加、在质膜下单层排列是评定卵母细胞胞质成熟的指标之一。
5.2.2 细胞器的变化 在卵母细胞成熟过程中，卵母细胞内的细胞器迁移和重新分布最为显著。随着卵母细胞胞质的成熟，线粒体、高尔基体、粗面内质网等细胞器由皮质层向中央区迁移。线粒体不断地增多，线粒体簇变大，着色变深，线粒体在卵胞质内呈均匀分布，如果线粒体仍在卵母细胞周边分布，其发育潜能较低，可见线粒体迁移与重新分布影响着卵母细胞的胞质成熟[33～35]。粗面内质网最早出现在小腔卵泡的卵母细胞中，卵母细胞成熟后，粗面内质网消失，但滑面内质网增多，其囊池膨大，形态不规则，与线粒体紧密相连。高尔基体连续合成、分泌皮质颗粒，同时高尔基体在逐渐消失，当卵母细胞成熟后高尔基体基本上完全消失[32]。高尔基体消失意味着皮质颗粒合成完成，卵母细胞做好了受精的准备。
5.2.3 卵膜和透明带之间卵周隙的变化 卵周隙是卵胞质成熟的指标之一。在未成熟的卵母细胞中，卵周隙尚未形成，在卵膜表面有大量的微绒毛分布，并且垂直植入透明带内。随着卵母细胞成熟，卵膜和透明带之间空隙逐渐扩大，微绒毛数量减少并逐渐从透明带中撤出，全部倒伏在卵膜表面，这时卵膜和透明带之间的腔隙称为卵周隙。正常成熟的卵母细胞，卵周隙距离适中，能在卵周隙内清晰地看到第一极体。如果卵周隙过小，说明极体刚刚释放，卵子成熟欠佳；
卵周隙越大，说明卵母细胞质量越差，这是由于细胞质过度收缩造成的。细胞质过度收缩可能有两个原因，一是卵子过度成熟导致胞浆皱缩，造成卵周隙变大：二是第一极体排出时伴随大量的糖蛋白释放，造成卵周隙变大。卵周隙大小对受精影响不大，但对其后期发育影响较大。
卵母细胞发育是一个从形态学到内部细胞学以及分子、蛋白、信号通路动态变化的过程，各个组成成分相互作用，构成了卵母细胞发育调控网络，但两次减数分裂是卵母细胞发育调控的主干网络。随着研究的不断深入，许多信号通路在卵母细胞生长发育过程中所起的作用越来越清晰，但还有哪些信号通路涉及到卵母细胞生长发育，以及信号转导途径中又有哪些下游靶基因参与等相关的问题仍未解决。因此，深入研究卵母细胞生长发育的调控机制，有助于逐步提高卵母细胞成熟的核、质成熟同步化，对于治疗卵源性不孕疾病有着重要意义。
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