报告最新统计，肺癌约占全球各种肿瘤新发病例的18%，已成为威胁人类健康的一大杀手。肺癌因其恶性程度高易发生转移等特点，使肺癌的死亡率在各种恶性肿瘤中居首位。虽然手术化疗以及放疗技术的发展使肺癌治疗有了很大的提高，但这类技术往往伴随着严重的副作用，给患者的身心带来严重伤害，而大量临床研究证实中医药在抗肺癌方面的有效性，可改善临床症状，提高生活质量，延长患者的带瘤生存期
因此，研究能够治疗肺癌的中药具有重要的临床意义，以使肺癌的治疗取得令人满意的效果
中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定，其主要机制有抑制合成抑制新生血管形成促进细胞凋亡免疫调节等。
淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevi-COITtU Maxim、箭叶淫羊藿E.Sagittatum Maxim、柔毛淫羊藿E.pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿E.ko-reanum Nakai的干燥叶，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用。淫羊藿历来都是我国传统中药中的一味补益药材，在历代医学书籍中都有记载。它除了具有坚筋骨、补肾阳等药用价值，还具有心血管保护、促进骨质形成、调节机体的免疫能力、抑制癌症等重要功效。目前对于淫羊藿的抑癌作用机制研究比较少，且主要集中在乳腺癌方面，且其抗癌的作用机制尚不明了。在前期实验中发现淫羊藿具有一定的抗肺癌效果，所以本实验通过小鼠Lewis肺癌模型，来研究淫羊藿的抗肺癌活性。
1材料
LABCONCO ClassⅡ生物安全柜（美国Labcon-co公司）；HERA Cell 150 CO2培养箱（美国热电集团）；COIC XDS-1B相差倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）；Anke TDL40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；便携式电子天平-PL1502-S（上海METTLERTLEDO仪器有限公司）；T06001天平（天津天马恒基仪器有限公司）；ZXC型紫外消毒车（江苏巨光光电科技有限公司）。
淫羊藿购于安徽滕王药业，批号20150206，经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林教授鉴定为朝鲜淫羊藿。
C57BL/6小鼠60只，雌性，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK（沪）2015-0002。实验动物饲养于江苏省中医药研究院SPF级实验动物中心，每笼7只，饲料与饮水保持充足。室温（25±1）℃，湿度（65±5）%，每天光照12 h，黑暗12 h。小鼠Lewis肺癌瘤株购于中国医学科学院肿瘤研究所。
顺铂（DDP，南京制药有限公司，规格20 mL/瓶，质量浓度13 g·L-1，批号20150204）；氯化钠注射剂（南京小营药业有限公司，规格100 mL/瓶，批号12012120808）；TNF-α，IL-10，IL-17，IL-2 ELISA试剂盒（联科生物科技有限公司，批号分别为201504，201503，201501，201504）。
2方法
2.1淫羊藿提取物的制备 称取1000 g淫羊藿，加入50%乙醇10 L煮沸1 h，一共2次，4层纱布过滤后，回收乙醇。5 000 r·min-1离心15 min，取上清，高压蒸气灭菌后，于4℃冰箱中贮存备用。
2.2 Lewis癌瘤细胞悬液的制备Lewis肺癌细胞培养至对数生长期用0.25%胰酶消化，于37℃，5%CO培养箱中消化2 min，待细胞呈流沙样流下时，迅速加入完全培养基终止消化，吹打细胞转移至离心管中（2000r·min-1离心2 min），收集底部细胞。用灭菌PBS将细胞制备成细胞悬液，显微镜下计数，调节细胞密度至1×107个/mL。接种于4只小鼠右腋下，取接种Lewis肺癌细胞5 d的小鼠，处死并于75%乙醇中浸泡2 min无菌条件取瘤组织中生长良好新鲜部分，按肿瘤质量（g）与细胞培养基（mL）1：10研磨成匀浆，多次离心弃去上清，最后用培养基混匀制成20 mL肺癌瘤细胞的混悬液。
2.3荷瘤动物模型的建立、动物分组及给药 分别于50只C57BL/6小鼠右侧腋下皮下接种0.2 mL肺癌瘤细胞悬液。实验中10只未接肿瘤细胞的小鼠作为空白组，接种小鼠随机分为5组：模型组，阳性药组（顺铂），淫羊藿高剂量组（10g·kg-1），淫羊藿中剂量组（6.67 g·kg-1），淫羊藿低剂量组（3.33g·kg-1）。每组10只小鼠。
淫羊藿高、中、低剂量组每天分别灌胃0.2 mL对应的淫羊藿提取物。空白组小鼠每天灌胃生理盐水0.2 mL。模型组小鼠每天灌胃生理盐水0.2 mL。阳性药组腹腔注射化疗药顺铂，每只小鼠注射0.2mL（相当于3 mg·kg-1），现配现用。连续给药11d，末次给药1 h后处死小鼠。剥离肿瘤，分别称重，并按下述公式计算指数。
抑瘤率=（1-给药组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）×100%
实体瘤生长指数=瘤重/体重
实体瘤生长抑制率=（1-给药组瘤生长指数/模型对照组瘤生长指数）×100%
处死小鼠后，取出脾脏及胸腺，分别称重，并按下述公式计算指数。
脾脏指数=脾脏质量/体重
胸腺指数=胸腺质量/体重
2.4小动物专用高频彩色超声仪 运用小动物专用高频彩色超声仪对小鼠肿瘤的体积进行测量，采用加拿大Visual Sonics产的Vevo 2100高分辨小动物超声成像系统（MS 400探头，频率30 MHz，探测深度8 mm，宽度10.36 mm，小鼠采取吸入2%异氟烷麻醉，仰卧位固定于37℃恒温加热板上，探头至于小鼠右腋下肿瘤处，记录各切面的面积，并将3个切面组合成一张三维图，计算肿瘤体积。
2.5 ELISA法检测血清中TNF-α，IL-10，IL-17，IL-2水平给药第11天，处死小鼠前小鼠眼球后静脉取血，3 000 r·min-1离心10 min，取血清。ELISA法检测血清中TNF-α，IL-10，IL-17和IL-2的含量。严格按照试剂盒提供具体步骤，将已知浓度的标准样本和未知浓度的样本加入微孔内检测，将生物素标记的抗特异性单克隆抗体同时温育洗涤后加入链霉素亲和专一过氧化物酶再经过温育和洗涤，去除未结合的酶后，然后加入酶的作用底物，和酶结合物同时作用，产生颜色的深浅和样本中的浓度呈比例关系，用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算小鼠血清中TNF-α，IL-10，IL-17，IL-2浓度。
2.6免疫组织化学检测肺癌中Ki67和P53蛋白的表达 将剥离下来的肿瘤组织制成石蜡病理切片，放置于65℃恒温箱中2h后，二甲苯溶液浸泡脱蜡，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇梯度浸泡脱水后，用重蒸水漂洗3～5气次后进行抗原修复。石蜡病理切片在柠檬酸缓冲溶液中煮沸后冷却10min，将柠檬酸缓冲溶液冲洗掉。Elivison两步法进行免疫组织化学染色，DM2500光学显微镜进行照片拍摄。
2.7蛋白免疫印迹法检测肺癌中Ki67和P53蛋白表达的影响 将剥离下来的肿瘤组织用PBS缓冲溶液冲洗2遍，用RIPA裂解液裂解组织（400 μLIRI-PA+4 μL IPMSF）提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜，封闭液封闭（4℃过夜），分别用Ki67抗体，P53抗体（1：200）和β-actin兔多克隆抗体（1：1000）孵育，室温轻摇180 min，用TBS洗涤3次（10 min/次）后，分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1：2 000）室温孵育120 min，TBS洗涤3次（15 min/次），最后X线片曝光显影和定影后观察结果。
2.8统计学处理 数据表示为x±s的形式，SPSS16.0统计软件分析数据，计量资料采用单因素方差分析，组间比较采用LSD，方差不齐用H检验，组间比较用N检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1淫羊藿对C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用
连续灌胃给药11 d，小鼠体内Lewis肺癌生长具有不同程度的抑制，并随淫羊藿剂量的增大而增高与模型组相比，淫羊藿高、中剂量组小鼠的肿瘤体积显著性降低（P<0.05），结果显示淫羊藿具有显著的抑制肿瘤生长的作用（图1）。随后将各组小鼠处死，解剖观察见肿瘤质硬有薄层膜状结构包绕表面，且有血管生长分布。淫羊藿提取物高、中、低剂量、顺铂对荷瘤小鼠的瘤体均有不同程度的抑制作用（表1）。阳性药组、淫羊藿高剂量组与模型组相比瘤体质量有极显著性降低（P<0.01），淫羊藿中剂量组与模型组相比瘤体质量有显著性降低（P<0.05）。肿瘤生长抑制率（IR）评价药物抗肿瘤疗效评价标准：IR<30%为无效：IR≥30%，并且P<0.05为有效。因此可认为淫羊藿具有抗肿瘤的效果。淫羊藿高剂量组实体瘤生长指数与荷瘤组相比有极显著降低（P<0.01），而淫羊藿中剂量组实体瘤生长指数与荷瘤有显著降低（P<0.05），进一步证实淫羊藿抗肿瘤的有效性。
3.2淫羊藿对小鼠免疫器官的影响 给药组和阳性药组脾指数和胸腺指数较荷瘤组均有下降，顺铂虽然具有很高的抑制肿瘤的作用，但同时对机体的免疫产生明显的抑制作用，其脾指数、胸腺指数均显著减小（P<0.01）；淫羊藿则对机体的免疫器官影响较小，能显著增加脾、胸腺指数（P<0.05，P<0.01），机体免疫功能几乎没有受到抑制（表2）
3.3淫羊藿对小鼠血清中TNF-α，IL-10，IL-17，IL-2的影响 与空白组相比，模型组小鼠血清中的TNF-α，IL-10，IL-17显著性上升（P<0.05）；与模型组相比，淫羊藿高、中、低剂量组小鼠血清中TNF-α，IL-10，IL-17显著性降低（P<0.05，P<0.01）；与空白组相比，模型组小鼠血清中的IL-2显著性下降（P<0.05）；与模型组相比，淫羊藿高、中、低剂量组小鼠血清中的IL-2显著性提高（P<0.05，P<0.01）（表3）。以上这些指标的变化，可从侧面反应出肿瘤细胞的多少，同时淫羊藿可能通过提高机体的免疫应激能力从而达到一定的抗肿瘤效果
3.4淫羊藿对小鼠Lewis肺癌中的Ki67和P53蛋白表达的影响 Ki67和P53蛋白是常用的检测癌细胞数量以及活跃程度的指标。与空白组相比，模型组Ki67的表达显著增强，P53的表达显著减弱，而淫羊藿高、中、低剂量3组与模型组相比，Ki67的表达显著降低，P53的表达显著增强，从而说明淫羊藿高中低剂量3组小鼠的肺癌细胞得到一定程度的抑制，进一步说明了淫羊藿具有一定的抗肺癌效果（图2）。
淫羊藿高、中、低剂量组与模型组相比，Ki67的表达显著降低，P53的表达显著增强，这与蛋白免疫印迹法检测的结果是一致的，进一步说明了淫羊藿具有一定的抗癌效果（图3）。
4讨论
本实验建立小鼠Lewis肺癌模型，观察淫羊藿对小鼠Lewis肺癌生长影响。结果显示，从肿瘤的体积和肿瘤的生长抑制率可以看出，淫羊藿具有一定的抑制小鼠Lewis肺癌肿瘤生长的效果。
脾是T细胞和R细胞定居的场所，也是机体对血源性抗原产生免疫应答的主要场所，是体内产生抗体的主要器官，在机体的防御、免疫应答中具有重要的地位胸腺是人或其他哺乳动物的中枢免疫器官，是T细胞分化、发育、成熟的场所。白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）是细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，是T细胞和自然杀伤细胞发挥作用参与免疫反应的关键参与者，同样水平的升高是诱导肿瘤细胞凋亡的重要信号。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF）是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是促进炎性反应的重要物质，能够有效的促进肿瘤组织坏死，其机制可能与细胞参与的细胞凋亡有关。TT-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。TL-10是抑制巨噬细胞的抗原提呈功能及合成细胞因子。实验结果表明，淫羊藿高中、低剂量组小鼠体重、脾和胸腺等免疫器官质量和指数与阳性药组相比明显增加，可认为淫羊藿显著改善小鼠生活质量，减轻化疗药物对免疫器官的损坏，提高机体免疫力。通过淫羊藿对小鼠血清中的TNF-α，IL-10，IL-17，IL-2的影响结果也可看出，淫羊藿可以提高机体的免疫力，说明调节免疫功能可能是其抗肿瘤作用机制的途径之一。
Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关。Ki67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是肺癌研究中的热门生物指标，可以通过了解恶性肿瘤的细胞增殖活性，阳性说明癌细胞增殖活跃。P53基因是一种抑癌基因，定位于人类染色体17p13.1，编码393个氨基酸组成的53 kD的核内磷酸化蛋白，被称为P53蛋白。P53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。通过免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法的检测结果可以看出，淫羊藿对C57BL/6小鼠Lewis肺癌的癌细胞具有一定的抑制作用，从而进一步说明淫羊藿具有一定的抗肺癌作用。
本实验发现淫羊藿对肺癌具有明显的抑制作用，其抑制肺癌的作用随剂量的增加而增高，并且具有一定的提高免疫调节能力的作用，为其应用于临床提供了实验基础，同时也提示了调节免疫功能可能是其抗肿瘤作用机制的途径之一。